Microscopio

Microscopio   Strumento che consente di osservare immagini opportunamente ingrandite di oggetti molto piccoli e vicini. (In particolare si intende con tale termine il microscopio ottico.) � Col microscopio, fig. con minuziosità eccessiva, con scrupolosità pedantesca. � Microscopio ottico, sistema ottico che fornisce immagini virtuali ingrandite. (Può essere di due tipi: microscopio semplice, detto comunemente lente di ingrandimento, e microscopio composto)  � Microscopio binoculare o stereoscopico, sistema costituito da due microscopi composti accoppiati in modo che l'osservazione possa essere compiuta con entrambi gli occhi e venga conservato l'effetto stereoscopico della visione diretta. � Microscopio a contrasto di fase, polarizzatore, a raggi X, elettronico, a emissione di campo, a effetto tunnel.  � Microscopio metallografico.  � Microscopio micrometrico, microscopio munito di micrometro oculare. � Microscopio acustico, strumento che ha le stesse funzioni del microscopio ottico, ma che utilizza fasci ultrasonici invece di fasci luminosi.

u Tecnologia

Il microscopio composto è costituito da due sistemi di lenti, detti obiettivo e oculare. L'obiettivo è sostanzialmente formato da un sistema di piccole lenti a distanza focale molto piccola, che dà di un oggetto posto vicino al fuoco un'immagine reale e ingrandita. L'oculare è spesso formato da due lenti convergenti e praticamente funziona come una normale lente di ingrandimento, dando un'immagine virtuale, ulteriormente ingrandita, dell'immagine reale fornita dall'obiettivo. La necessità di ottenere immagini pressochè perfette (e specialmente prive di aberrazioni) porta naturalmente a una grande complessità per il sistema ottico usato, in special modo per quanto riguarda l'obiettivo.

La distanza tra l'obiettivo e l'oculare, in qualsiasi microscopio, è invariabile; la messa a fuoco dell'oggetto da osservare viene effettuata mediante spostamento dell'intero complesso ottico del microscopio. L'oggetto (o preparato), ridotto, per lo più, a una lamina sottile, è posto su una lastrina di vetro (vetrino) ed è illuminato dal basso per mezzo di un condensatore ottico (illuminazione per trasparenza o a campo chiaro), oppure lateralmente (illuminazione in campo scuro). Per ottenere poi un maggior potere risolutivo si può porre tra il preparato e l'obiettivo una goccia di uno speciale liquido rifrangente (obiettivo a immersione).

Spesso, nell'analisi di un determinato preparato, è necessario servirsi di diversi obiettivi a potenze variabili; lo strumento è allora fornito di un dispositivo, detto “a revolver”, che permette, semplicemente spostando una placca girevole, di sostituire rapidamente i diversi obiettivi fra loro. Infine, per una esatta visione dell'immagine fornita dall'apparecchio, è necessario che l'occhio dell'osservatore coincida col così detto anello oculare, che è l'immagine reale dell'obiettivo, fornita dall'oculare.

Ingrandimento e potenza. L'ingrandimento G fornito da un microscopio è definito, come per tutti gli strumenti ottici, dal rapporto tra il diametro apparente dell'immagine e quello dell'oggetto visto a occhio nudo alla distanza minima di visione distinta D. L'ingrandimento è dato dalla formula

dove a è la distanza tra i due fuochi compresi tra l'obiettivo e l'oculare, f1 e f2 le distanze focali dell'obiettivo e dell'oculare. L'ingrandimento cresce quando si riducono le distanze focali e dipende anche dalla potenza visiva del singolo osservatore attraverso la quantità D.

La potenza P è invece funzione dell'angolo sotto il quale si vede, attraverso l'apparecchio, l'unità di misura della lunghezza; poichè risulta

la potenza è indipendente dall'osservatore.

Potere separatore. La visione distinta di oggetti sempre più piccoli non può tuttavia essere ottenuta semplicemente aumentando il potere di ingrandimento dello strumento; la diffrazione pone infatti un limite inferiore alla distanza di separazione fra due punti, se si vuole che le loro immagini risultino distinte. Si può mostrare che tale distanza minima vale: 1min. = 1,2l/2n sen a dove l è la lunghezza d'onda della luce usata per l'illuminazione dell'oggetto, n l'indice di rifrazione del mezzo interposto fra l'oggetto e l'obiettivo e a il semiangolo del cono di raggi utili che ha il vertice nel centro dell'obiettivo. Per esempio il limite per la luce bianca è di 1/3636 mm, per quella violetta 1/4654 mm.

Per aumentare il potere risolutivo si usano sorgenti di luce ultravioletta che non agiscono sull'occhio ma sulla lastra fotografica (ultramicroscopio). In questo caso si usa un obiettivo di quarzo e si possono separare due punti distanti fra loro un decimilionesimo di millimetro.

L'ultramicroscopio viene utilizzato per le ricerche su sospensioni colloidali dove occorre rilevare solo la posizione dei corpuscoli in sospensione. In questo caso per l'illuminazione si usa luce diffusa o diffratta.

L'ultramicroscopio è dotato di dispositivi a illuminazione laterale o riflessione totale, opera cioè in campo scuro, con il vantaggio di non disturbare l'osservatore con la luce proveniente dal fondo luminoso del campo.

v Cenni storici

L'invenzione  del microscopio composto viene da alcuni attribuita all'olandese Zacharias Janssen, secondo altri, invece, la scoperta si dovrebbe a Cornelis Drebbel o allo scienziato olandese A. Van Leeuwenhoek. Lo studio dell'acromatismo e delle aberrazioni geometriche, svolto principalmente da E. Abbe, contribuì in maniera determinante al miglioramento dello strumento, sino a raggiungere il grado di perfezione degli apparecchi odierni.

v Microscopio a contrasto di fase

Questo  tipo di microscopio permette di mettere in evidenza piccole variazioni dell'indice di rifrazione della sostanza osservata. I preparati microscopici sono, in generale, poco assorbenti (a causa del loro debole spessore), ma possono presentare delle variazioni di indice di rifrazione che costituiscono informazioni estremamente utili, ad es. per il biologo che studia la struttura di certi microrganismi.

Un artificio ottico, dovuto a F. Zernike, consente di mettere in evidenza piccolissime variazioni di fase nelle onde luminose che hanno attraversato un preparato; a questo scopo si interpone, nel condensatore, un diaframma anulare e dietro l'obiettivo si pone una lamina di fase costituita da un disco trasparente con un profondo solco di forma anulare che si sovrappone esattamente all'immagine del diaframma. Con questo artificio si introduce una differenza di fase dell'ordine di mezza lunghezza d'onda tra la luce incidente e quella diffratta dalle zone del campione con un maggior indice di rifrazione. Dall'interferenza che ne risulta le zone con un maggiore indice di rifrazione appariranno come zone quasi opache, così le variazioni di fase che si verificano nell'attraversamento dell'oggetto si traducono in variazioni di luminosità nell'immagine; in questo modo si possono facilmente mettere in evidenza differenze di spessore ottico dell'ordine di qualche decina di èngstròm solamente. La tecnica di contrasto di fase è molto usata dai biologi specialmente nell'osservazione degli organismi viventi. Risultati analoghi si possono ottenere, comunque, anche attraverso altre tecniche, come ad es. per interferenza o polarizzazione della luce emessa dall'oggetto.

v Microscopio polarizzatore

E'  un microscopio ottico munito di due prismi di Nicol oppure di filtri di polarizzazione. Il nicol polarizzatore, posto sotto il tavolino del microscopio, invia sull'oggetto un fascio di luce polarizzata in un piano; il nicol analizzatore, posto tra l'obiettivo e l'oculare, può ruotare. Quando i piani di polarizzazione dei due nicol sono incrociati ad angolo retto, il campo dello strumento appare scuro, tranne le zone corrispondenti a sostanze birifrangenti o dotate di potere rotatorio. Tale microscopio si usa soprattutto in mineralogia e in petrografia per studiare le caratteristiche ottiche dei minerali e delle rocce, preparate in sezioni sottili. Le osservazioni con un solo nicol o con nicol paralleli rivelano soprattutto l'esistenza o meno del pleocroismo e le sue caratteristiche. Le osservazioni con nicol incrociati si possono fare in luce parallela o in luce convergente. A nicol incrociati in luce parallela si osservano le caratteristiche delle sostanze birifrangenti, cioè orientazione ottica dell'ellissoide degli indici e potere birifrangente. Infatti le sostanze monorifrangenti, sempre, e quelle birifrangenti, solo quando sono in lamine tagliate perpendicolarmente a un asse ottico, restano sempre estinte ruotando il tavolino del microscopio, mentre lamine comunque orientate di sostanze birifrangenti sono estinte in quattro posizioni perpendicolari tra di loro e presentano nelle direzioni intermedie colori d'interferenza, variabili con lo spessore e con l'orientazione della lamina ma anche con la natura della sostanza, per cui ne costituiscono un dato diagnostico. Per le osservazioni con nicol incrociati in luce convergente si introducono, al di sotto del tavolino, una lente che fa convergere i raggi luminosi in un punto del preparato e, al di sotto dell'oculare, una lente, detta di Amici- Bertrand, che riporta l'immagine, formatasi nel piano focale dell'obiettivo, nel piano focale dell'oculare. In tali condizioni si osservano le cosiddette figure d'interferenza formate da un'isogira, che corrisponde alle zone di estinzione, e da curve isocromatiche, ciascuna delle quali corrisponde al luogo dei punti in cui i due raggi ordinario e straordinario escono dalla lamina con lo stesso ritardo. Nei cristalli monoassici l'isogira ha forma di croce e le curve isocromatiche sono circoli concentrici, il centro e i bracci dell'isogira rimangono fermi, ruotando il tavolino, se la lamina è tagliata perpendicolarmente all'asse ottico; ruotano, rimanendo però i bracci in direzione parallela, se la lamina è comunque orientata. Nei cristalli biassici, in lamine perpendicolari a un asse ottico, le isocromatiche sono ancora circoli concentrici e l'isogira assume la forma di un ramo di iperbole, il cui apice corrisponde all'emergenza dell'asse ottico e che ruota al ruotare del tavolino; in lamine perpendicolari alla bisettrice dell'angolo fra gli assi ottici, quando il piano degli assi ottici coincide con il piano di vibrazione di un nicol, l'isogira ha forma di croce nera e le curve isocromatiche di lemniscate; quando il piano degli assi ottici è a 45° con la direzione di vibrazione di un nicol, l'isogira ha forma di due rami di iperbole i cui apici corrispondono all'emergenza degli assi ottici e le isocromatiche di lemniscate allungate nella stessa direzione del piano degli assi ottici. In tali condizioni si può perciò osservare se una sostanza è monoassica o biassica, il valore approssimato dell'angolo fra gli assi ottici e, introducendo un compensatore, il segno della birifrangenza.

v Microscopio a raggi X

Questo  microscopio è usato prevalentemente nell'analisi di campioni che sono opachi alla luce ordinaria (come nello studio microscopico delle leghe e dei metalli). Schematicamente è costituito da una sorgente praticamente puntiforme di raggi X molli che irradia un campione e proietta la sua ombra su una lastra fotografica. L'ingrandimento è determinato dalla distanza della lastra dall'oggetto in esame. Le emulsioni sensibili utilizzate per queste microradiografie sono di tipo particolare, in modo da permettere forti ingrandimenti fotografici.

v Microscopio elettronico

Le  possibilità dei microscopi ottici sono seriamente limitate dal fenomeno della diffrazione della luce. A causa di tale fenomeno il potere separatore di un microscopio ottico non può scendere, nemmeno nelle circostanze più favorevoli, al di sotto del decimo di micron; inoltre gli ingrandimenti praticamente realizzabili non superano 2.000 diametri. D'altra parte, secondo i princìpi della meccanica ondulatoria, un fascio di elettroni veloci possiede una lunghezza d'onda che può essere anche 100.000 volte inferiore a quella delle radiazioni visibili. L'impiego di tali fasci elettronici come sorgenti “luminose” può quindi abbassare notevolmente il potere separatore e raggiungere ingrandimenti fino a 200.000 diametri; il microscopio elettronico si serve appunto di tali fasci di elettroni. Nei microscopi elettronici a trasmissione gli elettroni vengono emessi da un sottile filamento di tungsteno incandescente. Questi elettroni vengono accelerati da opportuni campi elettrici in modo da formare un fascio monoenergetico che viene collimato da un primo sistema di lenti (condensatore) e diretto sul campione in esame. Il fascio elettronico diffuso dal campione attraversa una lente magnetica (obiettivo) che forma un'immagine intermedia del campione. Questa immagine viene raccolta da un'altra lente magnetica (proiettore) che proietta l'immagine definitiva su uno schermo fluorescente o su una lastra fotografica. L'ingrandimento dipende essenzialmente dall'intensità di corrente che percorre le bobine del proiettore.

I microscopi elettronici a trasmissione forniti di cannone elettronico di 1 MV (Denver, Colorado) hanno potere risolutivo compreso fra 2 e 5 Ε, ingrandimento fino a 106 diametri. Ciò ha consentito in biologia la fotografia di singole molecole di cellule o di parti di virus, in metallurgia la fotografia di singoli atomi, ad es. di uranio o di torio.

Il microscopio elettronico a diffrazione è analogo al precedente ed è costituito da un tubo a raggi catodici. I raggi sono diffratti dall'oggetto esaminato e sono in seguito raccolti su una lastra fotografica. L'immagine di diffrazione che cosμ si ottiene viene analizzata con un apparecchio ottico ricombinatore.

Il microscopio elettronico a scansione funziona in modo analogo a un sistema televisivo in circuito chiuso. In un microscopio elettronico a scansione la superficie del campione viene colpita da un fascio di elettroni (prodotto da un cannone elettronico) il quale esplora tale superficie per azione di una bobina deflettrice, muovendosi come su uno schermo televisivo, con un numero di righe per quadro regolabile fra 100 e 1.000 (anzichι 625); gli elettroni secondari che vengono generati punto per punto dalla superficie vengono raccolti da un elettrodo collettore a 200 V per produrre un segnale elettrico; questo a sua volta modula l'intensità di un fascio elettronico su uno schermo televisivo, percorso in sincronia col fascio primario, sul quale si forma un'immagine tridimensionale.

Si comprende che tale microscopio differisce sia dal microscopio ottico sia dal microscopio elettronico a trasmissione, perchè in questi due ultimi le radiazioni attraversano il preparato, mentre nel primo l'informazione è dovuta a emissione secondaria. Non è quindi necessaria la focalizzazione e si può memorizzare l'immagine su nastri o dischi magnetici. Il suo potere risolutivo arriva a 100 Ε e l'ingrandimento a 100.000 diametri.

Microscopio a emissione di campo. Questo tipo di microscopio utilizza gli elettroni emessi dalle sostanze che vengono sottoposte all'azione di un campo elettrico molto intenso, per ottenere un'immagine molto ingrandita della superficie emittente. Quando si usano gli ioni positivi al posto degli elettroni prende il nome di microscopio ionico. Questi microscopi sono più potenti perchè in grado di produrre ingrandimenti di un milione di volte con un alto potere risolutivo. Risulta però difficile focalizzare il fascio emesso.

Attorno alla fine degli anni Settanta è stato messo a punto nel laboratorio dell'IBM di Zurigo il microscopio a scansione a effetto tunnel. Questo microscopio permette, a differenza di tutti gli altri, di esaminare strutture superficiali dei campioni atomo per atomo oltre a definire dettagli di dimensioni nell'ordine di quelle dell'atomo. La struttura del microscopio a effetto tunnel è costituita da due elementi sospesi a molle, inseriti in un telaio cilindrico di acciaio inossidabile; l'elemento interno contiene il microscopio. I due elettrodi, di una tipica configurazione a effetto tunnel, vengono sostituiti uno con il campione da esaminare e uno con una sonda a forma di ago appuntito. Per ottenere immagini ad alta risoluzione delle strutture di superficie il microscopio viene protetto dalle vibrazioni, anche minime, con piastre di rame e magneti. Il funzionamento di questo microscopio, come dice il nome, si basa sull'effetto tunnel degli elettroni, ossia sul fatto che in prossimità della superficie di un conduttore possa essere presente una nube di elettroni, la cui densità si riduce in modo esponenziale con la distanza. In questo modo si usano come unica sorgente di radiazione gli elettroni legati già presenti nella struttura del campione. Non sono perciò necessari obiettivi, luce speciale o sorgenti elettroniche. La capacità del microscopio a effetto tunnel di risolvere sia la topografia sia la struttura elettronica della superficie ne fa uno strumento indispensabile nella ricerca in campo fisico, chimico e biologico. Trova poi applicazioni industriali nella microelettronica, per l'analisi dell'architettura dei chip.

Lo schema semplificato di funzionamento del microscopio acustico è il seguente. Un trasduttore piezoelettrico genera un fascio parallelo di ultrasuoni a partire da un opportuno segnale elettrico; gli ultrasuoni utilizzati in questa applicazione hanno tipicamente lunghezze d'onda di un mm, e quindi frequenze di un GHz (un miliardo di Hertz). Il fascio si propaga in uno zaffiro che è a contatto col liquido — in genere acqua, più raramente argo liquido — nel quale è immerso l'oggetto da esaminare. La superficie di separazione tra zaffiro e liquido è accuratamente lavorata in forma di semisfera (diametro di qualche decina di mm) incavata nello zaffiro; si ha così una lente acustica che converge il fascio sul suo piano focale dove è posto l'oggetto. Il fascio riflesso ripercorre a ritroso il cammino di andata e viene infine convertito in un segnale elettrico che servirà poi per ricostruire l'immagine completa. L'intensità del segnale riflesso è massima e in fase col fascio incidente se l'oggetto è un riflettore ideale, perpendicolare cioè al fascio e perfettamente omogeneo; il segnale sarà invece minore e sfasato per superfici non perpendicolari e disomogenee; è su questo fatto che si basa il suo funzionamento. Il portacampione viene mosso in modo che ogni sua parte sia colpita dal fascio ultrasonico, allo scopo di ottenere un'immagine completa. Le prestazioni di un microscopio acustico sono confrontabili con quelle di uno ottico, come si può comprendere dal fatto che le onde usate hanno lunghezze d'onda confrontabili; va notato però che la scansione nel microscopio acustico richiede un tempo piuttosto lungo. Lo strumento si presenta per ora come complementare al microscopio ottico, particolarmente per lo studio di film sottili, di superfici di metalli e di materiali in genere e anche per campioni biologici, il cui esame non richiede, al contrario che nei microscopi ottici, l'uso di mezzi di contrasto. Un altro tipo di microscopio a scansione è il microscopio a interazione atomica, in cui, anzichè la corrente di tunneling, si registra il gradiente della forza repulsiva che si instaura fra le nubi elettroniche della punta e gli elettroni sulla superficie del campione da esaminare. Dato però che in questo caso la punta della sonda esercita una pressione sulla superficie del campione esaminato, la tecnologia può essere distruttiva, perciò in prospettiva potrebbe risultare più utile il microscopio a effetto attrattivo, che, anzichè la forza repulsiva, sfrutta quella attrattiva fra superficie del campione e punta della sonda (che in questo caso non tocca il campione, ma viene mantenuta a una distanza di qualche nanometro).

Di natura completamente diversa è il microscopio confocale (o microscopio a scansione a doppia focalizzazione), su principio brevettato nel 1961 da Marvin Minsky (uno dei padri fondatori dell'intelligenza artificiale), ma sfruttato realmente solo dagli anni Ottanta. Questo tipo di microscopio è indicato per l'esame di campioni di un certo spessore, in quanto consente di visualizzare ad alta risoluzione piani al di sotto della superficie, grazie a uno speciale metodo di focalizzazione della luce in un fascio a forma di clessidra, con il punto dove il fascio si fa più stretto che va a illuminare proprio la regione che si trova alla profondità desiderata.